Observer les cellules immunitaires pendant qu'elles attaquent les cellules cancéreuses 1 024 pièges, 14 heures et une pointe de pipette

Dans quelle mesure une cellule immunitaire parvient-elle à détruire une cellule cancéreuse, et combien de temps cela prend-il ? Les tests habituels ne fournissent que des valeurs moyennes. La puce CellTrap de l'Université technique de Munich (TUM) piège les cellules immunitaires et cancéreuses dans 1 024 micro-pièges et suit chaque interaction pendant une durée pouvant aller jusqu'à 14 heures, sans pompe ni équipement spécialisé.

Les immunothérapies, telles que la thérapie par cellules CAR-T ou CAR-NK, reposent sur un mécanisme fondamental : une cellule immunitaire reconnaît une cellule tumorale, s'y lie et la détruit. La survenue de ce processus et sa rapidité varient considérablement d'une cellule à l'autre. Les tests de cytotoxicité courants portent toutefois sur plusieurs milliers de cellules à la fois. Dans les tests de libération, les cellules immunitaires et cancéreuses sont cultivées ensemble dans des plaques à puits, et l'on mesure ce que les cellules mourantes libèrent dans le milieu de culture. La cytométrie en flux analyse certes les cellules individuellement, mais uniquement sous la forme d’un instantané d’une culture de masse à un moment donné. Ces deux méthodes indiquent le nombre de cellules cibles qui sont mortes, mais ne précisent pas quelle cellule immunitaire en était responsable, quand le contact a eu lieu ni si une cellule cancéreuse a été confrontée à un ou plusieurs agresseurs.

Les moyennes masquent les moments décisifs

Cette découverte a des implications pratiques. Les cellules immunitaires rares mais particulièrement actives disparaissent en moyenne, tout comme les cellules tumorales résistantes. De plus, les tests sur plaques en puits nécessitent un grand nombre de cellules, ce qui pose problème lorsque les cellules primaires ou les cellules immunitaires génétiquement modifiées sont rares.

C'est là qu'interviennent les systèmes microfluidiques : ils confinent un petit nombre de cellules dans des espaces définis et les observent au fil du temps. Les approches établies présentent toutefois leurs propres inconvénients. Les systèmes à gouttelettes encapsulent les cellules dans des émulsions huileuses ; cela empêche les interférences, mais le milieu ne peut pas être remplacé. Les nutriments contenus dans le minuscule volume des gouttelettes ne sont pas réapprovisionnés, ce qui limite la microscopie sur cellules vivantes sur de longues périodes, et les étapes de coloration a posteriori sont impossibles. Les plateformes qui appairent les cellules de manière ciblée, par exemple à l’aide de forces électriques, acoustiques ou optiques, atteignent des taux d’appariement élevés, mais nécessitent des pompes, des appareils spécialisés et de l’expérience. Les réseaux de micro-puits ouverts sont plus simples, mais les puits partagent un milieu commun, ce qui permet aux molécules libérées de se propager entre eux.

La puce : 1 024 pièges et une pointe de pipette

CellTrap (voir fig. 1), développé au Centre de recherche translationnelle sur le cancer (TranslaTUM) de l'Université technique de Munich (TUM), repose sur une approche délibérément simple. La puce est constituée de PDMS, un polymère de silicone transparent, et est fixée sur une lame porte-objet standard (25 mm × 75 mm). Un canal principal se ramifie symétriquement sur huit niveaux. À l’extrémité de ce réseau se trouvent 1 024 pièges de 30 µm de large chacun, disposés en une rangée d’environ 6 cm de long. Cela simplifie la capture d’images : la puce est balayée le long d’une ligne à l’aide d’un objectif 10x, et quelques dizaines d’images individuelles à haute résolution sont assemblées pour former une image globale de tous les pièges. Chaque piège se termine par deux ou trois canaux de filtrage, larges de seulement 2 µm et hauts de 4 µm. Le milieu de culture s’écoule à travers ceux-ci, tandis que les cellules sont retenues (voir fig. 2).

Aucune pompe n'est nécessaire. La suspension cellulaire est placée dans un embout de pipette de 1 ml, qui est inséré dans l'orifice d'entrée. Une colonne de liquide d'environ 10 cm de hauteur génère une pression d'environ 1 kPa et propulse environ 4 µl par minute à travers la puce. Un bouchon cellulaire de 20 µL contenant environ 2 000 cellules atteint les pièges en quelques minutes. De plus, le flux s’autorégule : dès qu’un piège est occupé, sa résistance à l’écoulement augmente et le liquide se dévie vers les pièges vides. Les cellules piégées se trouvent donc dans un environnement quasi-statique, soumis à une contrainte de cisaillement très faible. L'embout de pipette est ensuite remplacé par de petits réservoirs fermés, et la puce est placée sur un microscope à fluorescence équipé d'une chambre d'incubation, comme on en trouve dans de nombreux laboratoires de biologie cellulaire.

Le hasard comme principe de conception

Au lieu de rechercher des paires parfaites « un pour un », CellTrap mise sur le hasard. Les cellules immunitaires et les cellules cancéreuses sont mélangées puis chargées ensemble ; le nombre de cellules de chaque type qui se retrouvent dans un piège obéit à la loi de Poisson (voir encadré). Dans une expérience menée avec des cellules de glioblastome (U87) et des cellules NK, 142 des 1 024 pièges (environ 14 %) contenaient exactement une cellule immunitaire et une cellule cancéreuse, 42 pièges (4 %) contenaient deux cellules immunitaires et une cellule cancéreuse, et 36 pièges (3,5 %) présentaient la proportion inverse ; 537 pièges (un peu plus de la moitié) ne contenaient qu’un seul type de cellule et servaient de témoins (voir fig. 3). Une seule étape de chargement fournit ainsi plusieurs rapports effecteur/cible (E:T) et des témoins appropriés sur la même puce dans des conditions identiques. Cela réduit les variations entre les puits ou les expériences distincts. Les mesures réalisées avec des particules fluorescentes et avec des cellules correspondaient étroitement aux prévisions statistiques, ce qui permet d’ajuster la distribution en fonction de la concentration cellulaire.

Ce que la puce permet de voir

Afin de démontrer que la plateforme est capable de traiter des échantillons cliniquement pertinents, l’équipe a d’abord cultivé des cellules immunitaires issues du sang humain (cellules mononucléaires du sang périphérique, PBMC) stimulées par l’IL-2 avec des cellules de glioblastome exprimant une protéine fluorescente verte. En l’espace de 14 heures, le signal vert s’est estompé dans les pièges contenant des cellules immunitaires, tandis que les cellules cancéreuses dépourvues de cellules immunitaires sont restées intactes. Pour une caractérisation systématique, l’équipe a ensuite utilisé la lignée cellulaire NK standardisée NK-92 contre trois lignées cellulaires tumorales : glioblastome (U87), leucémie myéloïde chronique (K562) et adénocarcinome colorectal (LS174T). Le recours à une lignée cellulaire a été un choix délibéré : les cellules immunitaires provenant de différents donneurs de sang présentent de grandes différences, et une lignée cellulaire uniforme permet de distinguer les différences biologiques des effets techniques de la puce.

Deux paramètres se complètent. Au cours des premières minutes, la puce détecte des signaux calciques dans les cellules NK, l’un des premiers signes indiquant qu’une cellule immunitaire a reconnu une cible. Le profil du signal dépendait du type de tumeur : les cellules K562, dépourvues de molécules du CMH de classe I, provoquaient des pics brusques et marqués, tandis que les cellules U87 entraînaient une montée et une chute plus lentes. Les cellules immunitaires dépourvues de cellule cible ne présentaient pas ce type de signal. Même au sein d’un même piège, une cellule NK pouvait réagir vivement tandis que sa voisine restait inerte, une différence que les mesures effectuées sur des populations cellulaires ne permettent pas de distinguer.

Au bout de 14 heures, la puce indique si la cellule cancéreuse est morte. Les cellules tumorales sont marquées à l'aide d'un colorant bleu stable, et le milieu contient de l'iodure de propidium, un marqueur de cellules mortes ; seules les cellules présentant ces deux signaux sont considérées comme des cellules tumorales mortes. Les cas où des cellules se sont divisées ou ont échappé au traitement ont été exclus afin que chaque rapport reste clairement défini. Pour la lignée U87, environ 22 % des cellules cancéreuses sont mortes dans un rapport de 1:1, environ 13 % dans un rapport de 1:2 et environ 27 % dans un rapport de 2:1. Dans les contrôles correspondants, la mort cellulaire n’était que d’environ 1 % (cellules immunitaires uniquement) ou 4 % (cellules cancéreuses uniquement), et la viabilité des cellules sans partenaire était supérieure à 93 % (fig. 4). Un nombre plus élevé de cellules immunitaires par cellule cancéreuse augmentait généralement la destruction, mais pas de manière aussi marquée pour toutes les lignées cellulaires.

Avantages pour le laboratoire

Pour les utilisateurs, les avantages se manifestent surtout dans la pratique. CellTrap ne nécessite ni pompes ni appareils d’appariement, mais seulement une pipette et un microscope à fluorescence équipé d’un système de contrôle climatique. Le système fonctionne avec de faibles nombres de cellules. Et comme les pièges restent accessibles au flux, les réactifs peuvent être remplacés directement sur la puce : après huit heures de co-culture, l'équipe a fixé les cellules, les a rendues perméables et les a colorées avec l'enzyme cytotoxique granzyme B, sans les perdre hors des pièges. Les systèmes à gouttelettes ne permettent pas de tels protocoles en plusieurs étapes. L’analyse est également évolutive. L’ensemble de la rangée de pièges est capturé sous forme d’image microscopique composite, qu’un logiciel spécialement développé décompose en 1 024 images individuelles. Pour chaque piège, il est possible de déterminer le nombre de cellules et l’évolution de la fluorescence au fil du temps. Une seule puce fournit ainsi plusieurs centaines d’interactions cellulaires documentées, chacune avec son propre historique.

Applications et limites

CellTrap est un outil de recherche, et non un test diagnostique. Ses atouts se manifestent partout où les processus temporels et les différences entre les cellules individuelles jouent un rôle déterminant : lors de la comparaison de produits issus de cellules immunitaires, tels que des cellules NK ou T génétiquement modifiées, lors de l’évaluation de l’influence des principes actifs ou des anticorps sur la destruction cellulaire, ou encore pour comprendre pourquoi certaines cellules tumorales échappent à l’attaque. Le concept ne se limite pas aux cellules immunitaires et cancéreuses ; en principe, n’importe quelle combinaison de types cellulaires peut y être introduite. La prochaine étape consistera à réaliser des tests avec des cellules provenant de patients, ce qui pourrait à l’avenir faciliter le choix d’immunothérapies personnalisées. Cette conception présente toutefois des limites : chaque piège isole un petit groupe de cellules, de sorte que le réseau de signaux d’une tumeur réelle n’est pas reproduit, et les cellules très mobiles ou en division réduisent le nombre de pièges exploitables.

Originalpublikation: Khan MZU, Kafshgari MH, Dezfouli AB, Hayden O, Multhoff G, Destgeer G. CellTrap: an instrument-free microfluidic platform for cell–cell interactions at stochastically generated effector-to-target ratios. RSC Advances 16 (2026). DOI: 10.1039/D6RA02345B