sponsoriséMaladies transmises par les moustiques Homogénéisation à température contrôlée pour une détection fiable de l'ARN dans le cadre de la surveillance des moustiques

Comment le broyeur à vibrations MM 500 control de Retsch révolutionne la préparation des échantillons dans les laboratoires de surveillance

Les maladies transmises par les moustiques : un défi mondial croissant

En raison du changement climatique, de l'évolution de la biodiversité et de l'augmentation des déplacements, les agents pathogènes transmis par les moustiques, tels que le virus du Nil occidental, la dengue, le chikungunya et le virus Zika, ne cessent de se propager vers le nord. Pour la santé publique, cela nécessite une surveillance permanente des populations de moustiques avant qu’une épidémie ne se déclare. Les programmes de surveillance collectent les moustiques dans des pièges, les regroupent en « pools » (5 à 50 individus par échantillon) et les analysent par RT-PCR (réaction en chaîne par polymérase après transcription inverse) pour détecter la présence d’ARN viral. La qualité de la préparation des échantillons est déterminante pour la fiabilité des résultats. Le virus du Nil occidental et la dengue, en particulier, ont conquis de nouvelles zones de propagation en Europe ces dernières années – une évolution qui a incité les autorités sanitaires du monde entier à intensifier leurs programmes de surveillance. Plus la détection d’un virus dans le pool de moustiques est précoce, plus les mesures de lutte peuvent être ciblées, idéalement avant même l’apparition de cas d’infection chez l’homme. Pour les laboratoires de surveillance, cela se traduit par des milliers d’échantillons par saison, traités dans des délais analytiques très serrés.

Fonctionnement du système de régulation de la température du MM 500 control

Les plaques thermiques transfèrent la chaleur directement des bols de broyage vers le fluide de refroidissement. Les bols de broyage sont simplement posés sur les plaques thermiques, sans nécessiter de bains d'azote liquide à ciel ouvert ni l'utilisation de glace carbonique. Un système de fluide hermétiquement fermé permet un fonctionnement à l'eau ou avec un mélange eau-glycol (via un refroidisseur, à partir d'environ 4 °C), avec de l'huile thermique pour des plages de température plus élevées, ainsi qu'avec de l'azote liquide via le cryoPad en option pour des températures allant jusqu'à –100 °C. La précision de régulation du système est assurée, en cas d’utilisation d’azote liquide, par un procédé de régulation PID (proportionnel-intégral-dérivé) breveté, qui intervient activement dans le flux de refroidissement via le cryoPad. La température de consigne peut être réglée par paliers de 10 °C dans une plage comprise entre 100 et 0 °C et maintenue stable tout au long du cycle de broyage. Pour la surveillance des moucherons, le fonctionnement du refroidisseur a fait ses preuves dans la pratique : avec de l’eau refroidie à 4 °C, la suspension reste constante à environ 13 °C dans les tubes de réaction de 2 ml, sans aucune pause de refroidissement manuelle.

Débit d'échantillons accru : adaptateur pour 18 tubes de réaction de 2 ml

Un adaptateur spécial en aluminium permet d'accueillir jusqu'à 18 tubes Eppendorf (1,5 ou 2,0 ml) simultanément. L'aluminium transfère efficacement la température des plaques thermiques vers les tubes, de sorte que le refroidissement atteint les échantillons sans délai. Grâce à ses deux stations de broyage, le MM 500 control traite ainsi jusqu'à 36 échantillons en un seul cycle.

Pour les applications nécessitant la congélation ou un chauffage intense de l'échantillon, Retsch recommande d'utiliser des tubes en acier de 2 ml à la place des récipients de réaction en polymère, car ceux-ci résistent mieux aux contraintes mécaniques et thermiques extrêmes. L'adaptateur en aluminium peut accueillir 9 tubes en acier de 2 ml, ce qui offre une flexibilité maximale pour différents types d'échantillons et protocoles. Les récipients en plastique à usage unique, quant à eux, conviennent parfaitement à une utilisation de routine sans risque de contamination dans le cadre de la surveillance des moustiques.

Le défi : préserver l'intégrité de l'ARN lors de l'homogénéisation mécanique

L'ARN est nettement plus instable que l'ADN et est extrêmement sensible à la chaleur, au frottement et aux ARNases. Les procédés d'homogénéisation mécaniques classiques, par exemple avec des broyeurs à billes traditionnels, génèrent de la chaleur par frottement pendant le processus, ce qui peut endommager les molécules d'ARN, voire les dégrader complètement. Même des durées de broyage courtes peuvent faire augmenter la température de l’échantillon de 10 à 20 °C et entraîner une qualité d’échantillon inégale si les pauses de refroidissement sont effectuées manuellement et de manière irrégulière. À cela s’ajoute le fait que les méthodes de refroidissement traditionnelles, telles que le refroidissement manuel des adaptateurs dans un bain de glace, entraînent des interruptions du processus qui nuisent à la fois à la reproductibilité et au débit. Dans les laboratoires à haut débit qui traitent plusieurs centaines d’échantillons par jour en haute saison, ces pauses se traduisent par une perte considérable de temps et de qualité. Les laboratoires de surveillance sont donc confrontés à un dilemme fondamental : augmenter le débit d’échantillons ou garantir l’intégrité des échantillons – sans la technologie adéquate, il est impossible d’atteindre ces deux objectifs simultanément.

Débit d'échantillons plus élevé grâce aux broyeurs à vibrations

Le broyeur à oscillation Le MM 500 control est le premier broyeur à boulets au monde à surveiller et à réguler activement la température du processus de broyage. Grâce à son raccordement à un dispositif de refroidissement externe (par exemple un refroidisseur), la température de broyage reste contrôlable de manière constante tout au long du processus, sans interruption manuelle. L'appareil a reçu en 2022 le prix LABO du produit de l'année, ce qui souligne encore davantage l'importance de cette innovation dans le domaine de la technologie de laboratoire. Le MM 500 control fonctionne à une fréquence pouvant atteindre 30 Hz et permet d’obtenir une finesse finale d’environ 0,1 µm pour une taille maximale des particules d’alimentation de 10 mm. Outre le contrôle de la température, l’appareil séduit par un système de fixation ergonomique du bol de broyage, un écran tactile permettant de mémoriser jusqu’à 12 procédures opérationnelles standard (SOP), ainsi que la possibilité d’enregistrer jusqu’à quatre programmes de cycle différents comprenant chacun 99 répétitions.

Conseils pratiques et astuces pour la préparation des échantillons de moustiques

Protocole optimal pour l'extraction d'ARN à partir de pools de moustiques
 Les échantillons doivent être congelés sur de la glace carbonique ou dans de l’azote liquide immédiatement après leur prélèvement, car la dégradation de l’ARN commence en quelques minutes à température ambiante. Il est recommandé de pré-refroidir les godets de broyage et les adaptateurs à 4 °C avant de les mettre en place, afin de tirer le meilleur parti de la capacité de refroidissement du système dès le début. Les paramètres de broyage éprouvés pour les tissus de moustiques correspondent à une fréquence de 25 à 28 Hz et à une durée de broyage de 45 à 60 secondes par cycle, à une température de l’eau de refroidissement de 4 °C.

Le MM 500 control affiche en continu la température de la plaque thermique sur l'écran tactile, ce qui permet de s'assurer à tout moment que la suspension reste en dessous de 15 °C et que l'intégrité de l'ARN est préservée. Les billes en acier inoxydable de 2 ou 3 mm de diamètre ont fait leurs preuves comme corps de broyage pour les tissus de moustiques ; pour les applications d'ARN particulièrement sensibles, des billes de broyage en oxyde de zirconium peuvent être envisagées. La possibilité de stocker jusqu’à 12 procédures opérationnelles standard (SOP) dans l’appareil garantit la standardisation entre plusieurs opérateurs et tout au long de la saison.

Assurance qualité dans le cadre des opérations de routine
 Il est recommandé de procéder à un contrôle aléatoire de la qualité de l'ARN au début de chaque saison ainsi qu'à chaque changement de protocole, afin de valider la cohérence du traitement d'un lot à l'autre. Les tubes à réaction à usage unique (2 ml) éliminent complètement les opérations de nettoyage entre les lots, ce qui constitue un avantage décisif dans le cadre d’une surveillance à haut débit, où la contamination croisée entre les pools est inacceptable.

Exemples d'application concrets

Échantillons biologiques – Disruption cellulaire et homogénéisation tissulaire
 Outre la surveillance des moustiques, le MM 500 control fait ses preuves dans un large éventail d’applications biologiques – partout où les molécules thermolabiles et la reproductibilité des résultats sont primordiales. En virologie et en microbiologie, l’appareil est utilisé pour l’extraction d’ARN à partir d’échantillons tissulaires, de culots cellulaires et d’organoïdes ; dans la recherche pharmaceutique, il sert à l’homogénéisation à température contrôlée de comprimés, de gélules et de matrices biologiques. Le broyage cryogénique de substances aromatiques volatiles, par exemple à partir de grains de café à –20 °C, est un exemple tiré de l’analyse alimentaire qui souligne l’étendue des possibilités d’application.

Pour les laboratoires de surveillance qui traitent quotidiennement des centaines, voire des milliers d'échantillons groupés de moustiques, le broyeur à vibrations Retsch Mill MM 500 control constitue une avancée décisive vers une meilleure qualité des données et une plus grande efficacité des processus. La régulation active de la température préserve l'intégrité de l'ARN, améliore la reproductibilité d'un lot à l'autre et élimine les pauses de refroidissement manuelles qui prennent beaucoup de temps. Par rapport aux broyeurs à billes conventionnels sans régulation de température, le MM 500 control offre trois avantages décisifs : premièrement, un refroidissement direct et continu sans interruption du processus ; deuxièmement, la traçabilité complète et le stockage des procédures opérationnelles standard (SOP) pour les environnements de laboratoire conformes aux bonnes pratiques de laboratoire (BPL) ; troisièmement, la flexibilité de changer de fluide de refroidissement en fonction des besoins, du simple refroidisseur à l’azote liquide avec le cryoPad en option.