Conseils HILIC, 5e partieRégler correctement les sels pour la phase HILIC mobile
Une tribune libre de
Dr Thomas Letzel (directeur général, AFIN-TS) et al. (voir la fin du texte) | Traduit par l'IA
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L'ajout de sel à la phase mobile HILIC améliore la reproductibilité et la forme des pics, optimisant ainsi la qualité de la séparation. Mais quels sont les sels les plus adaptés ? Comment les dissoudre de manière fiable dans des phases mobiles à forte teneur en acétonitrile ? Et quelle est l'influence des sels sur la séparation ?
Fig. 1 : L'ajout de sels permet d'influencer la qualité de la séparation en HILIC. Ce conseil explique en détail l'effet des sels.
(Image : VCG – Lüttmann)
En règle générale, on ajoute des sels à la phase mobile afin de pouvoir contrôler les interactions électrostatiques entre les analytes chargés et la phase stationnaire. Cela permet d'améliorer la forme des pics des analytes élués en réduisant l'étalement des pics. Il convient toutefois de tenir compte de certains éléments.
Sels adaptés à la méthode HILIC
En règle générale, on utilise en HILIC des sels tels que l'acétate d'ammonium et le formiate d'ammonium, parfois aussi le bicarbonate d'ammonium (voir fig. 2). Il est intéressant de noter que ces sels se dissolvent également dans des mélanges de solvants présentant une forte teneur en acétonitrile, ce qui est typique de la HILIC au début des analyses. Par ailleurs, en raison de leur volatilité, ces sels sont compatibles avec la détection par spectrométrie de masse qui suit, une technique de détection fréquemment utilisée en HILIC. L’utilisation de sels moins solubles, tels que les phosphates, ou de réactifs formant des paires d’ions, comme le TFA, doit être évitée dans la mesure du possible si une détection par SM est envisagée. Toutefois, si l’on utilise des détecteurs spectroscopiques, des sels « non volatils » peuvent tout à fait être utilisés. Ces substances présentent des effets dits de « salification » accrus et peuvent avoir des effets cosmotropiques et chaotropiques sur les molécules chargées, c’est-à-dire renforcer ou perturber les liaisons hydrogène [1]. Mais cela nous mènerait trop loin ici ; on peut se reporter aux écrits d’Andrew J. Alpert pour en savoir plus.
La plupart des phases mobiles HILIC sont donc préparées en ajoutant de l'acétate d'ammonium ou du formiate d'ammonium. Ces deux sels ne peuvent pas être utilisés de la même manière, car le formiate d'ammonium confère à la phase mobile un pH plus acide que l'acétate d'ammonium.
Un mélange des deux sels permet de régler de manière ciblée le pH de la phase mobile dans une certaine plage.
Conseil : ne pas utiliser de carbonate d'ammonium pour la méthode HILIC
Nous déconseillons plutôt l'utilisation de solutions contenant du bicarbonate d'ammonium, car celles-ci ne sont que peu stables. Le dégagement de dioxyde de carbone peut entraîner une modification tant de la concentration en sel que du pH, ce dernier tendant de plus en plus vers une valeur basique.
Influence de la salinité
L'effet fondamental de la teneur en sel dans la phase mobile peut être décrit comme suit : Les sels influencent les interactions électrostatiques entre les molécules chargées et les matériaux de colonne chargés ou zwitterioniques (voir Conseil HILIC n° 3). En cas d’attraction électrostatique entre les analytes et la phase stationnaire, on observe que l’augmentation de la teneur en sel entraîne une diminution de la rétention.
Par conséquent, en cas de répulsion électrostatique entre les analytes et la phase stationnaire, c’est l’inverse qui se produit : l’augmentation de la salinité entraîne une rétention accrue de l’analyte correspondant.
Fig. 2 : Représentation schématique des sels utilisés dans la phase mobile de la méthode HILIC et de leur comportement mécanistique de base.
(Image : AFIN-TS)
Le deuxième effet lié à l'utilisation de sels ou à l'augmentation de la teneur en sel dans la phase mobile se manifeste par l'épaisseur de la couche d'eau à la surface des matériaux HILIC polaires. La forte teneur en éluant organique de la phase mobile au début d'une séparation oblige le sel à s'accumuler de manière préférentielle dans la couche d'eau. Une concentration croissante en sel entraîne donc une augmentation de l’épaisseur de la couche d’eau, ce qui s’accompagne généralement d’une rétention plus importante de tous les analytes polaires (à l’exception de ceux mentionnés ci-dessus). C’est pourquoi une teneur en sel significative entraîne également une rétention accrue pour les analytes polaires non chargés, même si ceux-ci ne peuvent pas former d’interaction électrostatique. Un schéma explicatif à ce sujet figure à la figure 2. Les travaux sous-jacents ont été menés par nos soins il y a environ 15 ans sur la phase ZIC-HILIC et publiés dans un article [2].
Praxistag HPLC
La journée pratique HPLC est le rendez-vous incontournable des techniciens de laboratoire, des responsables de laboratoire et des experts en applications issus de l’industrie et de la recherche, afin de discuter ensemble de la chromatographie liquide à haute performance, de se tenir informés des dernières avancées et de trouver des idées pour l’utilisation quotidienne des systèmes HPLC et de leurs composants. La prochaine journée pratique aura lieu les 28 et 29 octobre 2026 à Fürstenfeldbruck (Munich). Cette année, une visite guidée exclusive des locaux de Thermo Fisher Scientific, leader mondial dans le domaine des services scientifiques, vous attend. Les places pour la visite guidée sont limitées : n’attendez pas trop longtemps pour vous inscrire à l’événement !
Préparation de la phase mobile
Pour garantir une reproductibilité suffisante de la rétention et de la forme des pics, il est nécessaire d’avoir dans la phase mobile une concentration finale en sel d’au moins 5 mmol/L et de maintenir cette concentration stable en permanence. Nous avons déjà abordé ailleurs les effets d'un gradient de sel et ne les prendrons pas en compte ici [3]. La solubilité des sels dans la phase mobile à forte teneur en solvant organique peut toutefois s'avérer problématique et entraîne souvent la précipitation des sels dans la solution.
Dans le cas de phases mobiles contenant 95 % d'acétonitrile, la concentration en sel doit dans un premier temps être maintenue en dessous de 15 mmol/L en raison de la solubilité limitée de ce dernier.
Fig. 3 : Description schématique de la procédure de préparation de la phase mobile pour la HILIC. À titre d'exemple, cette figure décrit la préparation d'un litre d'un mélange d'acétonitrile et d'eau (95:5, v/v) à l'aide d'acétate d'ammonium. Source : utilisé et adapté à partir de icône « beaker-empty » et icône « filtration-1 » par Servier Medical Art ainsi que icône « reagent_bottle » par DBCLS ; toutes sous licence CC-BY 3.0 / 4.0.
Une procédure classique de préparation de phases mobiles pour la HILIC est illustrée à la figure 3. À titre d'exemple, nous allons préparer 1 L d'une phase mobile à base d'acétonitrile/eau (95:5, v/v) avec une concentration finale en acétate d'ammonium de 10 mmol/L. Il est essentiel que l’acétate d’ammonium soit d’abord entièrement dissous dans de l’eau pure. Pour ce faire, on prépare tout d’abord 50 mL d’une solution aqueuse d’acétate d’ammonium à une concentration de 200 mmol/L. Il suffit de remuer pour que le sel se dissolve complètement dans l’eau en quelques secondes. Ensuite, tout en remuant continuellement, on ajoute lentement 950 mL d’acétonitrile aux 50 mL de solution aqueuse d’acétate d’ammonium. On obtient ainsi 1 L d’une phase mobile présentant un rapport acétonitrile/eau de 95:5 (v/v) et une concentration finale en acétate d’ammonium de 10 mmol/L.
17.09.2026
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La solution finale peut alors présenter de petites billes troubles au fond de la bouteille. Cela indique une dissolution imparfaite du sel dans la phase mobile. L'utilisation de bouteilles en verre transparent peut aider à surveiller cet effet. Une agitation vigoureuse, voire pendant toute une nuit, n'améliorera pas la solubilité du sel. Cependant, pour dissoudre complètement le sel, il convient de placer la bouteille contenant la solution dans un bain à ultrasons jusqu'à ce que la solution devienne transparente et que les gouttelettes ou particules aient disparu. En règle générale, un traitement par ultrasons de 30 minutes est tout à fait suffisant.
Dès que le sel est complètement dissous, la phase mobile peut être filtrée comme d'habitude et est alors directement prête à être utilisée pour l'application chromatographique. Cette procédure peut également être appliquée à d'autres phases mobiles HILIC et modifiée si nécessaire. La teneur en eau, le type de sel et la concentration en sel peuvent être adaptés de manière ciblée à l'application concernée. Il est également important que le traitement par ultrasons soit reproductible. L'intensité et la durée de l'exposition aux ultrasons, en particulier, doivent toujours être maintenues constantes.
Effet de la teneur en sel
Outre son influence sur les interactions électrostatiques, la concentration en sel influe sur l'épaisseur de la couche d'eau, ce qui affecte également la rétention des composés non chargés. Un pourcentage élevé de solvant organique dans l'éluant a pour effet de pousser le sel de préférence vers la couche aqueuse. Une augmentation de la concentration en sel entraîne donc systématiquement un épaississement de la couche aqueuse. Ce double effet de la concentration en sel peut être observé dans certaines séparations. Exemple :
Fig. 4 : Séparation HILIC du 2-HB (pic n° 1) et du 4-HB (pic n° 2) à différentes teneurs en sel. Colonnes : YMC-Diol (150 × 2,1, 5 mm) ; Luna-NH2 (150 × 2,0, 5 mm) ; ZIC-HILIC (150 × 2,1, 5 mm). Éluant : ACN–eau, 90:10, avec 10 mM ou 15 mM d'acétate d'ammonium. Température de la colonne : 25 °C. Débit : 0,6 mL/min. Détection UV à 280 nm.
(Image : Adapté et repris de Greco et al., J. Chrom. Sci, 2013 [4], avec l'autorisation de l'éditeur.)
Séparation de l'acide 2-hydroxybenzoïque et de l'acide 4-hydroxybenzoïque (2-HB et 4-HB ; désignés par les numéros 1 et 2 sur la figure 4) sur trois colonnes présentant des propriétés différentes (comme illustré sur la figure 4 et tiré de l'original [3]). À pH neutre, les deux analytes se trouvent dans leur état chargé négativement en raison de la déprotonation du groupe carboxylique. Une augmentation de la concentration en acétate d'ammonium de 10 mM à 15 mM, avec une teneur constante de 90 % d’acétonitrile dans la phase mobile, entraîne pour le 4-HB un renforcement significatif de sa liaison à la colonne diol neutre et un temps de rétention plus long.
À titre d'information : le 2-HB comporte une liaison hydrogène intramoléculaire entre le groupe carboxyle et le groupe hydroxyle [5], de sorte que cette molécule se comporte ici de manière très « non polaire » sur le plan chromatographique (à l'instar, par exemple, le toluène) et n’est donc pas retardée sur une colonne HILIC neutre.
Revenons à la séparation polaire : la rétention nettement plus élevée à une salinité plus forte, due à l'épaisseur accrue de la couche d'eau, est particulièrement visible pour le 4-HB, notamment dans les phases neutres.
L'influence de la concentration en sel sur la rétention est également attribuée à un effet de salage [1]. Dans ce processus, les molécules d’eau sont davantage liées à la solvatation des ions de sel, ce qui réduit la solvatation des analytes et peut favoriser leurs interactions directes avec la phase stationnaire. Dans le cas de la phase amine chargée positivement, on observe une attraction électrostatique avec les deux molécules, c'est-à-dire avec les anions 2-HB et 4-HB (nettement plus marquée pour ce dernier en raison de son hydrophilie). Une augmentation de la concentration en sel entraîne une diminution de l’attraction électrostatique, ce qui se traduit par une diminution de la rétention.
Comme nous l'avons déjà évoqué, dans les phases stationnaires zwitterioniques, le groupe cationique interne entraîne une attraction électrostatique des analytes chargés négativement, tels que le 2-HB et le 4-HB. Parallèlement, ces analytes subissent une répulsion électrostatique due au groupe anionique externe de la phase stationnaire. Ces effets ne sont toutefois pas dominants, car l'effet principal n'est pas ici l'interaction électrostatique, mais plutôt l'épaisseur accrue de la couche d'eau en cas de concentration en sel élevée.
Dans le prochain conseil HILIC, nous nous intéresserons aux effets combinés des substances organiques et du sel.
Bibliographie
[1] A.J. Alpert : Effet des sels sur la rétention en chromatographie d'interaction hydrophile. Journal of Chromatography A 2018, 1538, 45-53
[2] G. Greco, S. Grosse et T. Letzel : Étude du comportement de rétention en chromatographie d'interaction hydrophile zwitterionique des acides hydroxybenzoïques et aminobenzoïques isomères. Journal of Chromatography A 2012, 1235, 60-67.
[3] T. Letzel : « Specifications of gradients in hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) » Dans : *Gradient HPLC for Practitioners: RP, LC-MS, Ion Analytics, Biochromatography, SFC, HILIC*. Stavros Kromidas (éd.) Wiley-VCH ; ISBN-10 : 352734408X ; 1re édition (17 avril 2019), p. 175-182
[4] G. Greco et T. Letzel : « Principales interactions et influences des paramètres chromatographiques dans les séparations HILIC ». Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.
[5] S. Grosse et T. Letzel : Chromatographie liquide / spectrométrie de masse à ionisation à pression atmosphérique avec mélange liquide post-colonne pour la détermination efficace d'hydrocarbures aromatiques polycycliques partiellement oxydés. Journal of Chromatography A 2007, 1139, 75-83.
Voir les autres conseils HILIC
Les auteurs
Dr Thomas Letzel
(Image : privé)
Dr Thomas Letzel : fondateur et directeur général de l'Institut de recherche analytique pour le criblage non ciblé (AFIN-TS), www.afin-ts.de
Thomas Letzel a suivi une formation de laborantin en chimie, puis a étudié la chimie et obtenu un doctorat en analyse environnementale. Il a ensuite effectué des séjours de recherche analytique à Amsterdam et à Munich (à l'université technique de Munich, où il enseigne également depuis 2009 en tant que chargé de cours en « chimie analytique et bioanalyse »). Depuis 2018, il mène des recherches et fournit des conseils (au sein du trio de fondateurs) avec son propre institut de recherche et s’est donné pour mission d’intégrer davantage la méthode HILIC en HPLC dans la pratique analytique quotidienne.
Dr Stefan Bieber
(Image : privé)
Dr Stefan Bieber : fondateur et directeur général de l'Institut de recherche analytique pour le criblage non ciblé (AFIN-TS)
Aux côtés de Thomas Letzel, Stefan Bieber dirige la société AFIN-TS GmbH en tant que directeur général et travaille depuis de nombreuses années dans le domaine du « non-target screening ».
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Dr Annette Dibowski
(Image : privé)
Dr Annette Dibowski :Directrice générale, Dichrom GmbH, www.dichrom.com
Annette Dibowski n'est pas seulement directrice générale de Dichrom et conseillère commerciale chez Biotech Fluidics, mais aussi une « exploratrice polaire » passionnée dans le domaine de la chromatographie des composés polaires.
En savoir plus sur HILIC
Les conseils HILIC sont aimablement fournis par le Dr Thomas Letzel et son équipe. Cette série d'articles a pour but de dissiper les appréhensions liées à cette méthode et d'en mettre en évidence le potentiel analytique. D'autres articles suivront au cours des années 2026 et 2027.
Pour toute question concernant HILIC , n'hésitez pas à contacter directement les responsables de ces conseils via leur page d'accueil : www.afin-ts.de (Dr Thomas Letzel et Dr Stefan Bieber) et www.dichrom.com (Dr Annette Dibowski)
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:quality(80)/p7i.vogel.de/wcms/ad/5e/ad5e2f8931b572413331d4876a631260/image1v1.png "Le nuage moléculaire de Persée se trouve à environ 1 000 années-lumière de la Terre. Autour d’au moins l’une des très jeunes étoiles qui y sont encore enfouies, on trouve une forme rare d’alcool organique, le méthanol. C’est la toute première fois que sa présence a pu être mise en évidence dans l’espace, comme le montre l’étude actuelle. (Image :Ekaterina Moerova / MPIfR ; image d'arrière-plan : NASA, CXC, SSC, NOAO, DSS ; image 3D de Methanol : https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Methanol#section=3D-Conformer)")
:quality(80)/p7i.vogel.de/wcms/38/c5/38c52304e83d5b61e3021a408ea60d02/csm-178-molekuel-peak-banerjee-weismann-c-sophie-humbert-1478-ad1e9281b5v1.jpeg "Le Dr Alexander Weismann (à gauche) et le Dr Arnab Banerjee étudient l'excitation des molécules à l'aide d'un microscope à effet tunnel. (Image :Sophie Humbert, Université de Kiel)")
![Fig. 4 : Séparation HILIC du 2-HB (pic n° 1) et du 4-HB (pic n° 2) à différentes teneurs en sel. Colonnes : YMC-Diol (150 × 2,1, 5 mm) ; Luna-NH2 (150 × 2,0, 5 mm) ; ZIC-HILIC (150 × 2,1, 5 mm). Éluant : ACN–eau, 90:10, avec 10 mM ou 15 mM d'acétate d'ammonium. Température de la colonne : 25 °C. Débit : 0,6 mL/min. Détection UV à 280 nm.(Image : Adapté et repris de Greco et al., J. Chrom. Sci, 2013 [4], avec l'autorisation de l'éditeur.)](https://cdn1.vogel.de/OC_1Aq9Q3GAUxt4B2k7WbEnBWdk=/fit-in/540x0/smart/p7i.vogel.de/wcms/42/f4/42f4a902aec8b66f18e20164c02e2830/0133603248v1.jpeg "Fig. 4 : Séparation HILIC du 2-HB (pic n° 1) et du 4-HB (pic n° 2) à différentes teneurs en sel. Colonnes : YMC-Diol (150 × 2,1, 5 mm) ; Luna-NH2 (150 × 2,0, 5 mm) ; ZIC-HILIC (150 × 2,1, 5 mm). Éluant : ACN–eau, 90:10, avec 10 mM ou 15 mM d'acétate d'ammonium. Température de la colonne : 25 °C. Débit : 0,6 mL/min. Détection UV à 280 nm.(Image : Adapté et repris de Greco et al., J. Chrom. Sci, 2013 [4], avec l'autorisation de l'éditeur.)")
:quality(80)/p7i.vogel.de/wcms/db/1a/db1a15a63e80a63e677265b1f0d905a7/0131424816v1.jpeg "Fig. 1 : Exemple du bisphénol A (BPA) : l'Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) a ramené la dose journalière admissible (DJA) pour le BPA à 0,2 ng/kg de poids corporel par jour. Les méthodes standard utilisées jusqu'à présent ne sont donc plus suffisamment sensibles. (Image symbolique) (Photo : ©Ivan Uralsky - stock.adobe.com)")
:quality(80)/p7i.vogel.de/wcms/3e/fd/3efd9a8b2147b0c40d56c508b5334b6d/0130556742v1.jpeg "Fig. 1 : Les PFAS peuvent également pénétrer dans l'organisme humain par le biais de l'environnement et de l'alimentation. Parallèlement, en raison de leur grande stabilité et de leur grande mobilité, les PFAS constituent un défi pour la surveillance environnementale. (Image symbolique) (Photo : ©Stanislav - stock.adobe.com)")