Microfluidique automatisée Une approche plus simple pour l'imagerie haute résolution de nombreuses structures cellulaires

La microscopie à super-résolution permet de visualiser les agencements moléculaires avec une précision de l'ordre du nanomètre. Cependant, les expériences multiplexes complexes nécessitent encore de nombreuses heures de travail manuel. La microfluidique automatisée simplifie ces processus, améliore la reproductibilité et ouvre la voie à la microscopie intelligente.

Pendant des décennies, l'un des principaux objectifs de la microscopie a été d'atteindre une résolution spatiale toujours plus élevée. La microscopie moderne à super-résolution (SRM) a désormais repoussé cette limite jusqu'à environ dix nanomètres. Elle permet ainsi de visualiser des structures à l'échelle nanométrique et l'organisation des protéines, qui ne peuvent être distinguées à l'aide de la microscopie optique classique.

D'une résolution plus élevée à davantage d'informations biologiques

Les systèmes biologiques sont toutefois complexes. Une cellule contient de nombreux organites et structures qui interagissent entre eux. Leur organisation spatiale est étroitement liée à la fonction cellulaire. C'est pourquoi les chercheurs souhaitent aujourd'hui non seulement obtenir des images aussi nettes que possible de structures individuelles, mais aussi étudier le plus grand nombre possible de composants d'une cellule ou d'un tissu dans leurs relations spatiales les uns par rapport aux autres.

La microscopie à super-résolution multiplexée est ainsi devenue un outil essentiel de l'imagerie biologique moderne. Cela pose toutefois un défi pratique : plus on cherche à obtenir d'informations à partir d'un échantillon, plus les procédures expérimentales deviennent complexes – et plus il est difficile de les réaliser manuellement.

DNA-PAINT permet le multiplexage moléculaire

En microscopie à fluorescence multicolore classique, différentes structures sont marquées à l'aide de fluorophores de différentes couleurs. Dans la pratique, cependant, seul un nombre limité de structures cibles peut être distingué de manière fiable les unes des autres. 

DNA-PAINT adopte une approche différente : de courtes séquences d'ADN codent l'identité de différentes molécules cibles. Des sondes d'ADN complémentaires, marquées par fluorescence, génèrent ensuite les signaux nécessaires à l'imagerie haute résolution. Le point essentiel est que différentes structures cibles peuvent être visualisées successivement avec le même colorant fluorescent. Cela permet de contourner de nombreuses limites de la microscopie multicolore conventionnelle.

Dans la technique dite « Exchange-PAINT », des sondes d'ADN fluorescentes sont introduites les unes après les autres dans l'échantillon, puis retirées. De cette manière, de nombreuses structures au sein d’un même échantillon biologique peuvent être rendues visibles les unes après les autres. Cette méthode offre ainsi une grande flexibilité pour les expériences multiplexes ; toutefois, sa mise en œuvre pratique devient de plus en plus complexe à mesure que le nombre de structures cibles à étudier augmente.

Le travail manuel devient un goulot d'étranglement

Chaque cycle d'imagerie Exchange-PAINT comprend l'ajout des sondes d'ADN, la prise d'images et plusieurs étapes de lavage. Une expérience multiplexe nécessite donc de nombreux changements de solution et dure généralement plusieurs heures.

Si ces étapes sont réalisées manuellement, elles nécessitent une attention constante. Des variations au niveau du pipetage, du lavage ou des temps d'incubation peuvent affecter la reproductibilité et, en fin de compte, la qualité de l'image. Parallèlement, la réalisation manuelle limite le débit d'échantillons.

C'est là que réside l'un des principaux défis de la microscopie moderne : alors que les technologies d'imagerie ne cessent de gagner en performance, de nombreuses procédures expérimentales reposent encore sur une manipulation manuelle des échantillons. Leur automatisation peut donc s'avérer tout aussi importante que le perfectionnement du microscope lui-même.

La microfluidique automatise le processus d'imagerie

Afin de remédier à ce goulot d'étranglement, nous avons mis au point une plateforme microfluidique automatisée dédiée à la microscopie à super-résolution multiplexée.

Au lieu de remplacer manuellement les solutions d'imagerie, différents réactifs sont acheminés par des canaux fluidiques distincts et introduits dans la chambre d'échantillonnage sous le contrôle d'un logiciel. Une commande douce à air comprimé permet un changement de solution rapide et reproductible, tout en minimisant la contrainte exercée sur l'échantillon et en réduisant la consommation de réactifs.

Au lieu de remplacer manuellement les solutions d'imagerie, différents réactifs sont acheminés par des canaux fluidiques distincts et introduits dans la chambre d'échantillonnage sous le contrôle d'un logiciel. Une commande douce à air comprimé permet un changement rapide et reproductible de solution, tout en minimisant la contrainte exercée sur l'échantillon et en réduisant la consommation de réactifs.

Le système a été délibérément conçu comme un système modulaire complémentaire et peut être associé à des plateformes de microscopie existantes. Pour les expériences plus complexes, il est possible d'ajouter facilement des canaux fluidiques supplémentaires si nécessaire.

Cela présente des avantages évidents pour le quotidien du laboratoire : une meilleure reproductibilité, moins de travail manuel, une consommation réduite de réactifs et un débit d'échantillons plus élevé. Surtout, les protocoles d'imagerie complexes peuvent être standardisés sans qu'il soit nécessaire d'effectuer manuellement chaque étape.

Un défi particulier : les cellules du myocarde, particulièrement fragiles

Les avantages d'un apport contrôlé de liquide sont particulièrement évidents dans le cas d'échantillons biologiques sensibles.

Les cardiomyocytes primaires sont de grandes cellules du muscle cardiaque qui, pour certaines, n'adhèrent que faiblement à la surface de la chambre d'échantillonnage. Des lavages manuels répétés peuvent soumettre les cellules à un stress mécanique, voire les détacher de la surface. Or, pour l’imagerie multiplexée, il est indispensable que la même cellule reste stable tout au long de plusieurs cycles d’acquisition successifs.

La plateforme microfluidique génère un écoulement de liquide contrôlé avec précision et en douceur. Cela a permis de renouveler à plusieurs reprises les solutions DNA-PAINT sans endommager les cardiomyocytes au cours de l'expérience.

Cette approche a permis de visualiser cinq structures cibles différentes au sein de chaque cardiomyocyte. Les images de super-résolution obtenues montrent la disposition détaillée, à l'échelle nanométrique, des protéines associées à la membrane au sein d'une même cellule. Parallèlement, ces résultats démontrent que la microfluidique automatisée permet de réaliser des images multiplexées complexes, même avec des échantillons biologiques sensibles.

De la fluidique automatisée à la microscopie automatisée

Les possibilités offertes par l'automatisation microfluidique vont bien au-delà du simple échange de sondes d'ADN.

Le système fonctionnant par commande logicielle, le changement de solution peut être directement intégré à la prise d'images. Le microscope pourrait d'abord capturer la première structure marquée par fluorescence, puis effectuer automatiquement les opérations de lavage et le remplacement de la sonde d'ADN avant de poursuivre la prise d'images.

De cette manière, il est possible d'automatiser non seulement une étape de travail isolée, mais aussi, à terme, l'ensemble du flux de travail expérimental. Les expériences complexes, qui nécessitent aujourd’hui une supervision continue par des utilisateurs expérimentés, pourraient se dérouler selon des protocoles standardisés avec un minimum d’intervention manuelle. La microscopie à super-résolution multiplexée pourrait ainsi devenir plus facilement accessible aux non-spécialistes, aux centres d’imagerie et aux études à grande échelle.

La prochaine étape consiste non seulement à automatiser ces flux de travail, mais aussi à les rendre adaptatifs. Les informations d'image recueillies au cours de l'expérience pourraient être analysées par le logiciel et utilisées pour déterminer la prochaine étape expérimentale – par exemple, l'ajustement des paramètres de prise de vue, la sélection d'une nouvelle région d'image ou le remplacement ciblé d'une solution.

Vers une microscopie intelligente

Le microscope modulaire à lame lumineuse microscope à lame lumineuse Flamingo.

Flamingo a été conçu comme une plateforme d'imagerie portable dont l'optique, le matériel et les logiciels peuvent être adaptés à différentes exigences expérimentales. Son architecture modulaire offre ainsi une base appropriée pour combiner la fluidique automatisée avec l'acquisition d'images et des protocoles de microscopie adaptatifs.

La vision à long terme est celle d'un microscope intelligent dans lequel l'imagerie, la manipulation des échantillons et l'analyse des données ne se déroulent plus comme des étapes distinctes. Au contraire, les informations recueillies pendant l'acquisition pourraient piloter l'expérience en temps réel – par exemple en sélectionnant des zones d'image pertinentes, en ajustant les paramètres d'acquisition ou en déclenchant un changement de solution.

La microfluidique joue ici un rôle important : elle permet non seulement au microscope d'observer un échantillon, mais aussi d'interagir de manière ciblée avec celui-ci et de contrôler son environnement avec précision.

L'automatisation au-delà de la microscopie

Ces mêmes principes peuvent également être appliqués en dehors du domaine de la microscopie à fluorescence multiplexée. Les expériences en nanotechnologie de l'ADN et en auto-organisation moléculaire nécessitent souvent l'ajout et le retrait de composants moléculaires à un moment précis. La microfluidique automatisée peut assurer ce contrôle tout en réduisant la consommation de réactifs et en améliorant la reproductibilité.

Des concepts similaires pourraient également s'avérer intéressants pour de nouvelles approches expérimentales à la croisée de la nanotechnologie et des sciences quantiques, dans lesquelles des environnements chimiques contrôlés avec précision et des procédures expérimentales automatisées jouent un rôle important.

La microfluidique automatisée est donc bien plus qu'une simple solution pour les opérations de pipetage répétitives. En combinant la manipulation contrôlée des échantillons et la microscopie pilotée par logiciel, elle devient un élément clé d'une nouvelle génération de plateformes expérimentales automatisées et adaptatives.

Originalpublikation: Basak, S.; Chi-Vu, K.; Mougios, N.; Oleksiievets, N.; Pollack, Y.G.; Brandenburg, S.; Opazo, F.; Lehnart, S.E.; Enderlein, J.*; Tsukanov, R.*, “A versatile microfluidics platform for enhanced multi-target super-resolution microscopy”. ACS Nano, 20 (2026)